PRAKTIKUM FRAKSINASI

TUJUAN PRAKTIKUM:

Memisahkan golongan-golongan senyawa pada tumbuhan hingga diperoleh zat murni menggunakan metode fraksinasi corong pisah dan kromatografi kolom

TINJAUAN PUSTAKA

Fraksinasi

Fraksinasi merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari kandungan golongan utama yang lainnya. Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan kepolaran tergantung dari jenis senyawa yang terkandung dalam tumbuhan.

Dalam metode fraksinasi pengetahuan mengenai sifat senyawa yang terdapat dalam ekstrak akan sangat mempengaruhi proses fraksinasi. Oleh karena itu, jika digunakan air sebagai pengekstraksi maka senyawa yang terekstraksi akan bersifat polar, termasuk senyawa yang bermuatan listrik. Jika digunakan pelarut non polar misalnya heksan, maka senyawa yang terekstraksi bersifat non polar dalam ekstrak. Pada prakteknya dalam melakukan fraksinasi digunakan dua metode yaitu dengan menggunakan corong pisah dan kromatografi kolom.

Corong pisah adalah peralatan laboratorium yang digunakan dalam ekstraksi cair-cair untuk memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran antara dua fase pelarut dengan densitas yang berbeda yang tak tercampur.

Umunya salah satu fase berupa larutan air dan yang lainnya berupa organiklipofilik seperti eter, MTBE, diklorometana, kloroforom, ataupun etilasetat. Kebanyakan pelarut organik berada di atas fase air kecuali pelarut yang memiliki atom dari unsur halogen. Pemisahan ini didasarkan pada tiap bobot dari fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada pada bagian dasar sementara fraksi yang lebih ringan akan berada di atas. Tujuannya untuk memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari kandungan yang lain. Senyawa yang bersifat polar akan masuk ke pelarut polar dan senyawa non polar akan masuk ke pelarut non polar.

Corong pemisah berbentuk kerucut yang ditutupi setengah bola, mempunyai penyumbat di atasnya dan di bawahnya. Corong pemisah yang digunakan dalam laboratorium terbuat dari kaca borosilikat dan kerannya terbuat dari kaca ataupun teflon. Ukuran corong pemisah bervariasi antara 50 ml sampai 3 L. Dalam skala industri, corong pemisah bisa berukuran sangat besar dan dipasang sentrifuge.

Untuk memakai corong ini, campuran dan dua fase pelarut dimasukkan kedalam corong dari atas dengan corong keran ditutup. Corong ini kemudian ditutup dan digoyang dengan kuat untuk membuat dua fase larutan tercampur. Corong ini kemudian dibalik dan keran dibuka untuk melepaskan tekanan uap yang berlebihan. Corong ini kemudian didiamkan agar pemisahan antara dua fase berlangsung. Penyumbat dan keran corong kemudian dibuka dan dua fase larutan ini dipisahkan dengan mengontrol keran corong.

Kromatografi Kolom

Terjadinya proses pemisahan dapat dengan cara :

1. Adsorpsi - Adsorpsi komponen atau senyawa diantara permukaan padatan dengan cairan (solid liquid interface) - Agar terjadi pemisahan dengan baik, maka komponen-komponen tersebut harus mempunyai afinitas yang berbeda terhadap adsorben dan ada interaksi antara komponen dengan adsorben

2. Partisi - Fase diam dan fase gerak berupa cairan yang tidak saling bercampur - Senyawa yang akan dipisahkan akan berpartisi antara fase diam dan fase gerak. Karena fase diam memberikan daerah yang sangat luas bagi fase gerak, maka pemisahan berlangsung lebih baik.

Penyiapan kolom

Pemilihan ukuran kolom a. Tergantung jumlah sampel yang akan dipisahkan, perbandingan adsorben-cuplikan (30:1) b. Perbandingan panjang dengan diameter kolom (10-15:1) c. Untuk sampel yang multikomponen yang mempunyai afinitas yang sama terhadap adsorben maka dipilih kolom yang panjang, sedangkan untuk komponendengan afinitas yang berbeda terhadap adsorben maka dipilih kolom yang pendek.

Cara melakukan adsorben ke dalam kolom: 1. Metode kering 2. Metode basah 3. Metode bubur/lumpuran

Penggunaan kolom

1. Sebelum dilakukan elusi, kolom dibasahi dulu dengan sejumlah fase gerak yang akan digunakan.

2. Sampel dimasukkan ke dalam kolom dalam bentuk padat maupun cair Sampel bentuk padat : • Dicampur dengan adsorben sampai merata, kemudian dengan hati-hati dimasukkan ke dalam kolom yang sudah berisi adsorben • Pada kromatografipartisi, sampel dilarutkan dalam fase diam, kemudian dicampur dengan bahan penyangga, baru ditempatkan di atas adsorben Sampel bentuk cair : Dilarutkan/dicampur dengan fase gerak, kemudian dengan hati-hati dimasukkan ke dalam kolom yang sudah berisi adsorben.

3. Setelah sampel masuk kolom, biasanya dilakukan pencucian terlebih dahulu baru dielusi dengan fase gerak. Untuk mendapatkan hasil elusi yang baik, umunya kecepatan fase gerak diatur 1-5 ml/menit.

4. Setelah elusi selesai, kromatogram dapat dideteksi dengan : - Berdasarkan warna sampel, bila yang dielusi berwarna - Dengan sinar UV 366nm - Disemprot dengan larutan/reagen penampak bercak

ALAT DAN BAHAN

A. Alat:

1. Corong pisah

2. Kolom kromatografi 3. Gelas ukur

4. Beaker glass

5. Erlenmeyer

6. Batang pengaduk

7. Kapas

8. Pipet 9. Botol vial

B. Bahan: 1. Ekstrak Temu Giring (Curcuma heyneana val.)

2. Metanol

3. Pelarut n-heksan

4. Pelarut etil asetat

5. NH4OH

6. Eluen (n-heksan:etil asetat = 1:1)

7. Adsorben silika gel GF 60

8. H2SO4

9. CHCl3

Prosedur Kerja :

A. Corong pisah

1. Cara kerja seperti pada bagan : 2. Semua proses dilakukan dalam corong pisah

3. Setelah didapat beberapa fraksi, fraksi-fraksi tersebut disimpan dalam botol vial

4. Simpan di lemari es.

B. Kromatografi Kolom

1.Siapkan kolom kromatografi, lalu bagian bawah kolom dimampatkan dengan kapas secukupnya

2.Masukkan adsorben ke dalam kolom dengan cara kering yaitu dengan memasukkan silika gel GF 60 sedikit demi sedikit ke dalam kolom sampai padat

3.Masukkan pelarut/eluen n-heksan:etil asetat (1:1) sebanyak 9 ml ke dalam kolom perlahan-lahan jangan sampai terbentuk rongga

4.Kemudian masukkan ekstrak ke dalam kolom, akan terjadi elusi hingga senyawa terpisahkan dan terbentuk pita-pita senyawa yang berwarna

5.Pita senyawa dikeluarkan dari kolom kemudian tampung ke dalam vial masing-masing sebanyak 3 ml

6.Simpan di lemari es.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Berdasarkan tabel 4.1.2 terlihat bahwa Fraksi I didapat cairan keruh berwarna kuning kehijauan dengan volume 10 mL. Fraksi II didapat cairan bening berwarna merah darah dengan volume 20 mL. Fraksi III didapat cairan bening berwarna kuning kehijauan dengan volume 15 mL.

Berdasarkan tabel 4.1.3 terlihat bahwa Fraksi I didapat Cairan berwarna merah darah atau merah tua, Fraksi II didapat Cairan berwarna merah agak orange, Fraksi III didapat cairan berwarna orange, Fraksi IV didapat cairan berwarna kuning tua, Fraksi V, VI, VII didapat cairan berwarna kuning muda, dengan jumlah volume masing-masing fraksi sebanyak 3 ml.

Berdasarkan tabel 4.1.2 terlihat bahwa Fraksi I didapat cairan keruh berwarna kuning kehijauan dengan volume 10 mL. Fraksi II didapat cairan bening berwarna merah darah dengan volume 20 mL. Fraksi III didapat cairan bening berwarna kuning kehijauan dengan volume 15 mL. Fraksi I didapat dengan cara menambahkan ekstrak yang terdapat di corong pisah dengan penambahkan 5 mL H2SO4, 5 mL n-heksan, dan 5 mL Etil Asetat. Fraksi I didapat setelah dilakukan pengocokan selama 15 menit kemudian corong pisah didiamkan sehingg terdapat dua lapisan. Lapisan atas merupakan lapisan n-heksan yang berwarna kuning susu kehijauan bersifat non polar karena n-heksan tersebut akan melarutkan atau menarik zat-zat yang bersifat non polar. Sesuai literature metode penapisan fitokimia bahwa fraksi hasil ekstrak adalah senyawa terpenoid dan fenol. Fraksi II diperoleh dengan mengekstraksi lapisan asam atau lapisan bagian bawah dari hasil ekstraksi pertama yang berwarna kuning jernih dengan cara menambahkan NH4OH hingga diperoleh pH 10, tambahkan n-heksan dan methanol (3:1). Fraksi II didapat setelah dilakukan pengocokan selama 15 menit. Setelah itu akan terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah merupakan lapisan air-asam yang berwarna merah darah. Dalam literatur penapisan fitokimia, ekstrak tersebut adalah ekstrak yang bersifat polar yaitu alkaloid kuartener dan n-oksida. Fraksi III diperoleh dari lapisan yang berada di atas yang merupakan lapisan n-heksan – methanol berwarna kuning kehijauan bening. Dalam literatur penapiasan fitokimia, ekstrak tersebut adalah ekstrak basa yang bersifat semi polar yang kebanyakan adalah alkaloid.

Berdasarkan table 4.1.3 terlihat bahwa Fraksi I didapat Cairan berwarna merah darah atau merah tua, Fraksi II didapat Cairan berwarna merah agak orange, Fraksi III didapat cairan berwarna orange, Fraksi IV didapat cairan berwarna kuning tua, Fraksi V, VI, VII didapat cairan berwarna kuning muda, dengan jumlah volume masing-masing fraksi sebanyak 3 ml. Dari hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa Fraksi I merupakan fraksi yang memiliki daya kelarutan yang tinggi terhadap fase gerak dan kurang terserap atau terabsorbsi pada fase diam sehingga fraksi tersebut lebih cepat bergerak keluar melalui kolom. Dan sebaliknya untuk Fraksi VII merupakan fraksi yang kurang larut dalam fase gerak dan lebih kuat terserap atau terabsorbsi pada fase diam sehingga fraksi tersebut lebih lambat bergerak keluar melalui kolom.

Fraksi-fraksi tersebut didapat dengan metode pemisahan menggunakan kromatografi kolom secara basah yaitu dengan cara cairan fase gerak dimasukkan terlebih dahulu ke dalam kolom kemudian ditambahkan fase diam berupa zat padat. Setelah itu masukan ekstrak temugiring yang ingin dipisahkan dan diamkan sampai terbentuk fraksi atau pita-pita dalam kolom tersebut. Pada praktikum kali ini kami menggunakan cara basah agar meminimalkan resiko terjadinya keretakan fase diam akibat kekeringan atau kurang ratanya penyerapan fase gerak bila dibandingkan cara kering maupun bubuh atau lumpuran. Pada saat menuangkan fase diam ke dalam corong usahakan agar serbuk tersebut tidak menempel pada dinding kolom dan tidak terbentuk rongga udara yang mengakibatkan pemisahan berjalan tidak sempuna.

Disusun Oleh :

KELOMPOK 5 (LIMA)

KONVERSI 2012 - XA

G.A.P MARLIANA NIM 1204017021

PUTRI MUTIARA LESTARI NIM 1204017041

SELVI DWI CAHYANINGSIH NIM 1204017044

TUTI SURAHMAN NIM 1204017051

YULIANI PRATIWI NIM 1204017056

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA

2012